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ノーバスビジュアルプロトコルシリーズへようこそ このビデオでは蛍光灯のすべてのフェーズを実行する方法を学習します
免疫細胞化学 このアッセイのための最も一般的な方法を使用しています。 ICCの手順を開始する前に、我々は準備をする方法を紹介します
カバーガラスと我々の細胞のメッキに続いて細胞培養プレート。 私達はのために塩酸の1モルに新しいカバースリップを治療する酸によって開始
24時間。 慎重に酸をオフデカントし、カバーガラスを除去した後、 私たちは、蒸留水でそれぞれを洗う
その後、最終的には、エタノールですすいでください。 オプションの手順としては、下塗ラックにカバースリップを置くことができます
沈めること 0.1ミリグラム/溶液ゼラチンまたはポリリジン 5分間。 への細胞のさらなる遵守を提供する上で、これらのコーティングの補佐官
カバースリップ 彼らは後に洗浄工程中に切り離されていないことが保証されます。 治療後の文化に下塗ラックを削除し、カバーガラスを乾燥
フードや加熱されたオーブン。 きれいな乾いたカバースリップをし、よく6の各ウェルに挿入され
培養皿 と蓋で覆われている。 時間を節約するために、プレートの大ボリュームは、後で使用するために事前に準備しておくことができます。 プレートもフードのUV光の下にそれらを置くことによって滅菌することができる。
6ウェルプレートで調製したきれいなカバーグラスで、 我々は今我々の細胞を追加することができます。
ウェルあたり半分万個の細胞の密度は、追加の細胞でここPlatted。 次いで、細胞をインキュベーターで一晩培養したり、お好みに達するまでアール
密度。 前日と一晩培養した細胞上に播種し、我々は準備ができている ICCの手順で起動します。 ICCのこの最初の日に、我々は、修正されます
透過処理、 ブロットおよび細胞に一次抗体を加える。 井戸の固定続いてそれぞれから培地を吸引することにより開始
4%ホルムアルデヒドまたは10%ホルマリンを持つ細胞 室温で10分間インキュベートした。
固定液を吸引除去し、氷冷PBSで各ウェルに二回すすいでください。 細胞はこの中で乾燥させないように注意してください
またはプロトコルの任意のさらなるステップ。 目的タンパク質のエピトープが細胞内で発現されている場合は、
抗体へのアクセスを得るために細胞透過性が必要である セル。 さまざまありますが 透過処理剤としては、最も一般的なのは、0.1アール - 0.5パーセント
濃度 のTween-20の またはトリトン-X100 PBSで希釈した。 のTween-20が細胞質内に位置するエピトープに使用され
トリトン-X100は透過核とミトコンドリアのために使用される。 室温で10分間透過処理用緩衝液でウェルをインキュベートする。
透過処理バッファーを吸引除去し、それぞれで5分間3回洗浄 PBSより糸。 PBSのより糸は0.1%Tween-20を含んでいます。
我々は今、1時間ブロッキングバッファーで非特異的結合部位をブロックします 室温で。 最高のブロッキングバッファーは、ホストからの10%血清を含むPBSTである
あなたの二次抗体の種。 しかし、 PBST中の1%BSAを用いてもよい。
ブロッキング緩衝液で希釈して一次抗体を準備 データシートで指定された推奨される希釈で。
複数緊密希釈が可能な変数を考慮に有益である あなたのアッセイで異なる 最良の結果を達成するため。
一晩4℃でインキュベートする。 私たちの例では、 我々は非抱合プライマリを使用しているので、我々は蛍光体を使用することになります
2日目二次共役。 私たちのICCの手続きの日2で 我々は、我々の二次抗体を加えます
、任意の二重標識や核ラベリングステップを実行 、スライドに私達のカバースリップをマウント
および蛍光顕微鏡で私たちの抗体の画像を得る。 まず、細胞を洗浄することにより、以下の一次抗体液を吸引
5分ごとにPBSTで3回。 次の一次にバインドしますfloraform標識二次抗体を作製 抗体。 二次ブロッキングバッファーを希釈
データシートで指定されたおすすめの希釈 1時間、インキュベートし、室温。
ホイルでプレートを覆うことの劣化感受性色素を防ぐことができます。 細胞の洗浄に続いて二次抗体溶液を吸引
PBSTで3回 5分間ずつ。 オプションの手順として第二のプライマリおよびセカンダリペアを使用することができます 第2のエピトープを可視化する
それのために別のフロアを使用します。 そのようなDAPIなどに加えて、DNA結合色素
二次抗体を必要とせずに適用することができます。 倍増する方法の詳細な手順については、完全な記述ノーバスプロトコルを参照して、
トリプルラベル。 カバーガラスは現在、顕微鏡スライド上にマウントする準備が整いました。 ゆっくりして洗浄したスライドを取ると、退色封入剤の一滴を免ずる
ピペットのプランジャーを下にダイヤルする。 慎重に、井戸からカバースリップを削除
過剰な洗浄が垂れることができる そして細胞がスライド上に伏せて置きます。
明確な爪磨きをカバースリップを封印し、それを防ぐために使用することができます 乾燥。 スライドは現在、顕微鏡下で可視化することができる
または-20℃または4℃で保存されて ダークスライドボックスやスライドブックインチ
各スライドは、顕微鏡の光の意志側近にさらされる時間を制限する 蛍光信号を延長 と退色を防ぐことができます。