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ノーバスビジュアルプロトコールシリーズへようこそ。 このビデオでは、使用したウエスタンブロットのすべてのフェーズを実行する方法を学習します
このアッセイのための最も一般的な方法。 我々はブロットの準備を開始する前に、まず私たちのサンプル溶解液を準備する必要があります。
この例では、培養細胞からタンパク質溶解物をご用意しております。 ここでは、氷冷PBSと十分な溶解緩衝液で細胞を2回洗浄
セルをカバーする。 溶解緩衝液の選択は、ローカライゼーションに大きく依存 目的タンパク質の。 我々は、細胞をこすり、遠心管に細胞溶液を移す
氷上に置いた。 膜結合タンパク質を可溶化するために、我々はより強く必要となります 抽出用洗剤は、単離された細胞質タンパク質に比べて。
この例では、一般的なバッファである標準RIPA緩衝液を使用している 最大のタンパク質収量を得るため。すべてからタンパク質を抽出しながら
細胞の局在、 それはあなたの溶解緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤を含めることが非常に重要となるでしょう あなたのサンプルの劣化を防ぐ。常に作りたてのプロテアーゼを使用する
阻害剤は、氷の上に試料を保持し、迅速に作業。 我々上下にピペッティングにより細胞をシラミ
30分間氷上でインキュベートした。 その後、ペレットに細胞を遠心分離する。
ペレットを捨て、上清を回収する。これはあなたのライセートです。 することにより、サンプル溶解液の総タンパク質濃度を決定
市販のタンパク質とライセートの小さな部分をテスト そのようなBCAとして定量分析。
これはあなたのゲルに等量のタンパク質をロードする際に役立つことでしょう。 ウェスタンブロットは、伝統的に減少し、そして変性下であらかじめ形成されています
条件。 これらの条件は、タンパク質はその分子量によって分離することができるようになります 母国配座形状や電荷ではなく。
サンプルを削減し、変性させ、 このような従来のLaemmliバッファーとしてローディングバッファー内の各希釈します。
このバッファは、ジスルフィドを低減するために、β-メルカプトエタノール、またはDTTが含まれています システイン間の尾根、 SDSは、正味の負のタンパク質を提供変性支援する
グリセロールのサンプルが各ウェルにシンクできるようにするには、 ライセートを可視化するためのブロモフェノールブルー
象徴的なバッファ。 Votex 5分のために摂氏95度で各サンプルとインキュベート 完全にタンパク質を変性。あなたは今にあなたのサンプルをロードする準備が整いました
SDS-PAGEゲル。