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膜への我々のタンパク質のエレクトロの後、我々は現在、ブロックされます ブロット、 その後、私たちの対象となるタンパク質および二次抗体の一次抗体の特定を適用
これは、一次抗体を認識します。 カセットから膜を除去し、中で3回洗浄することにより開始
水。 オプションのステップとして、我々は、タンパク質が正常に転送されたかどうかを確認することができます ポンソー赤色で膜を染色することにより、。
5分間ポンソーで膜をインキュベートとなるまで水で洗う バンドがはっきりしている。 検証後ブロットは、その後で洗浄し続けることで、脱染色することができる
水またはTBSより糸は色素まで完全に除去される。 我々は既に、タンパク質を含まないブロットのすべての領域をブロックする必要があります。
これは、抗体の非特異的結合を防ぎ、全体的な削減します バックグラウンド信号。 一般的なブロッキングバッファーは、アッセイのための5%脱脂粉乳を含む
TBSのより糸ソリューションインチ リン酸化特異的抗体でプローブするときそれができるようにしかし、牛乳を使用していない
セシウム、その内因性リン酸化タンパク質から高いバックグラウンドを引き起こす。 室温で1時間ブロッキング溶液で膜をインキュベート
わずかな撹拌下。 ブロッキング液を除去し、5分間TBSより糸で洗ってください。 今、私たちは抗体を追加する準備が整いました。一次抗体を希釈
データシートに推奨濃度でブロッキングバッファーを。 穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートする。
推奨されるオプションのステップはまた、抗体をロードポジティブコントロールを使用することです ユーザーは合計等量のタンパク質を確認することを可能にする各々にロードされた
よく、任意の不確実性を除去することによって、トラブルシューティングに側近 ウェスタンブロットの手順で。翌日、一次抗体オフデカントと
TBSのより糸と激しく攪拌し、大量のメンブレンを洗浄 5分ごとに5回。 これらの厳格な洗浄は、非特異的な除去に非常に重要である
バックグラウンド信号。 洗浄後、ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈し、 濃度で室温で1時間メンブレンをインキュベート
データシートをお勧めします。 今回の例では二次は後にもHRPに共役である
検出。 デカント膜とでTBSのより糸、大量の二次洗浄 5分ごとに、激しく撹拌しながら5回。これで準備ができている
検出フェーズ。