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前日と一晩培養した細胞上に播種し、我々は準備ができている ICCの手順で起動します。 ICCのこの最初の日に、我々は、修正されます
透過処理、 ブロットおよび細胞に一次抗体を加える。 井戸の固定続いてそれぞれから培地を吸引することにより開始
4%ホルムアルデヒドまたは10%ホルマリンを持つ細胞 室温で10分間インキュベートした。
固定液を吸引除去し、氷冷PBSで各ウェルに二回すすいでください。 細胞はこの中で乾燥させないように注意してください
またはプロトコルの任意のさらなるステップ。 目的タンパク質のエピトープが細胞内で発現されている場合は、
抗体へのアクセスを得るために細胞透過性が必要である セル。 最も一般的な多くの異なる透過処理エージェントがありますが、
0.1アール - .5%のTween-20の濃度または トリトン-X100 PBSで希釈した。 のTween-20が細胞質内に位置するエピトープに使用され
トリトン-X100は透過核とミトコンドリアのために使用される。 室温で10分間透過処理用緩衝液でウェルをインキュベートする。
透過処理バッファーを吸引除去し、5分間3回洗浄 PBSのより糸を持つ各。 PBSのより糸は0.1%Tween-20を含んでいます。
我々は今、1時間ブロッキングバッファーで非特異的結合部位をブロックします 室温で。 最高のブロッキングバッファーはから10%血清を含むPBST中です
あなたの二次抗体の種をホストします。 しかし、PBST中の1%BSAを用いてもよい。
推奨ブロッキングバッファー中で、それを希釈することにより、一次抗体を準備 データシートで指定された希釈。
複数緊密希釈はその変数を考慮に有益である あなたのアッセイであっても異なってもよく、
最良の結果を達成するため。 一晩4℃でインキュベートする。 我々は非抱合プライマリを使用しているので、私たちの例では、蛍光体を使用することになります
2日目二次共役。