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ノーバスビジュアルプロトコールシリーズへようこそ。 このビデオでは、使用したウエスタンブロットのすべてのフェーズを実行する方法を学習します
このアッセイのための最も一般的な方法。 我々はブロットの準備を開始する前に、まず私たちのサンプル溶解液を準備する必要があります。
この例では、培養細胞からタンパク質溶解物をご用意しております。 ここで 私たちは、氷冷PBSで細胞を2回洗浄
細胞をカバーするために、十分な溶解バッファー。 溶解緩衝液の選択は、主としてあなたに依存
目的のタンパク質の選択。 我々は、細胞をこすり、遠心管に細胞溶液を移す 氷上に置いた。 膜結合タンパク質を可溶化するために、我々はより強く必要となります
抽出用洗剤は、単離された細胞質タンパク質に比べて。 この例では、 我々は標準的なRIPA緩衝液を使用している、
これは最大のタンパク質収量を得るための一般的なバッファです。抽出中 すべての細胞のローカライズからのタンパク質、
それはあなたの溶解緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤を含めることが非常に重要となるでしょう あなたのサンプルの劣化を防ぐ。常に作りたてのプロテアーゼを使用する
阻害剤は、氷の上に試料を保持し、迅速に作業。 我々上下にピペッティングにより細胞をシラミ
氷上で30分間インキュベートした。 その後、ペレットに細胞を遠心分離する。
ペレットを捨て、上清を回収する。これはあなたのライセートです。 あなたのタンパク質溶解物の総濃度を決定することで
あなたのライセートの小さな部分をテスト 市販のタンパク質定量アッセイで
そのようなBCAなど。 これはあなたのゲルに等量のタンパク質をロードする際に役立つことでしょう。 ウェスタンブロットは、一般的に還元され、変性の下にあらかじめ形成されています
条件。これらの条件は、タンパク質はそのことによって分離することができるようになります 分子量 母国配座形状や電荷ではなく。
サンプルを削減し、変性させ、 このような従来のLaemmliバッファーとしてローディングバッファー内の各希釈します。
このバッファは、ジスルフィド尾根を低減するために、β-メルカプトエタノール、またはDTTが含まれています システイン間、 正味の負のタンパク質を変性させることを支援するため、SDS、
グリセロールのサンプルが各ウェルにシンクできるようにするには、 ライセートと象徴的なバッファを可視化するブロモフェノールブルー。
Votex 5分のために摂氏95度で、各サンプル 完全にタンパク質を変性。今、あなたのサンプルをロードする準備が整いました
SDS PAGEゲルに。 この次のステップのために我々は、サンプル中の個々のタンパク質を分離します 溶解物 それらの分子量に基づいて、
負に荷電したタンパク質を引き付けるために正極を用いた。 これを行うには 我々は、市販に我々の先に調製したタンパク質サンプルを読み込む
ポリアクリルアミドゲル。 ゲルは、アクリルアミドの一定のパーセンテージまたはグラデーションで利用可能です。 ゲルのアクリルアミド割合が小さく高い
パーセンテージ。 したがって高い割合ゲルは低量のタンパク質のためのより良いですが、割合が低い 大量のタンパク質と勾配ゲルを使用することができるためゲルが優れている
すべてのサイズのタンパク質 細孔径でのさまざまな範囲に起因する。 電気泳動装置に挿入してあなたのゲルを調製し、
あなたのゲル化学のために適切である、ランニングバッファーを充填。 ランニングバッファーでゲルのウェルをすすぎにバッファを追加
チャンバー。 ウェルにあなたのサンプルをロードします。 あなたは、ロードする量がわからない場合は、
全タンパク質の10〜30マイクログラムが示唆出発点です 同様にロードされたサンプルの全体量として。
また、予め染色分子量のためによく、少なくとも1を確保する必要があります はしご。 はしごは、中にタンパク質の分離を監視することができます
電気泳動し、その後中に試料中のタンパク質の重量を確認する 後で分析する。 電気泳動装置を閉じて、電源に接続します。ほとんどのユニット
典型的には、200ボルトで45〜60分を実行 またはローディングバッファーがゲルの底に到達するまで。
この時間の間に、各試料中の負に帯電したタンパク質は、向かって移行します ポリアクリルアミドを介して自分の道を作って正に帯電電極
ゲルマトリックス。 この次のステップでは、ゲルのうち、当社の個別のタンパク質を転送します と固体膜またはブロットに。 これは前のステップと同じ元本に基づいている
その中で電界が負のタンパク質を除去するために充電され 正極に向かって。 転送が濡れていたり、半乾燥条件下で発生する可能性があります。
ここでは、従来の湿式転写法のデモンストレーションを行います。除去することによって開始 そのカセットからゲル 井戸を含む上部を切断。
指示されたゲルの向き左上隅をノッチ。 転送サンドイッチを準備しながら転写バッファーでゲルをフロートさせます。
転送サンドイッチを作るには、 あなたは、カセットが必要になります
スポンジ、濾紙 ゲル とPVDFまたはnitrocellulous膜のいずれかのあなたの選択。 PVDFは最初にエタノールに膜を浸漬することによって、アクティブにする必要があります
2分。しかし、このPVDFまたはnitrocellulousの選択以外の 膜は、個人的な好みです。 ブロットの方向を示すために、左上隅にノッチ
そして10分間転写バッファーでメンブレンをインキュベートする。 次のコンポーネントを配置することによってスタックを作成
黒の負極から正極に赤: スポンジ、 ろ紙、 膜、 (素手でゲルやメンブレンに触れて使用しないように注意してください
清潔なピンセットやスパチュラ代わりに。 どの段階で膜に触れると、ブロットを汚染する可能性があります
過度のバックグラウンド信号。 ) ろ紙 とスポンジ。 優しくする可能性のある泡をロールアウトする各レイヤでクリーンローラーを使用して
現在 気泡が効率的なタンパク質転移を阻害することになるからです。 カセットをロックし、風邪を含む装置に置き
転送バッファ カセットが正しくマイナスからプラスに配置されることを保証する。 熱の蓄積を防止するためには、寒さで転送するために有益である
装置内のパック 装置やチャンバーの下部に配置スピナーバー付き寒い部屋インチ チャンバーを閉じて、電源に接続します。
あるメーカーの指示に従って転送を実行 三〇から一二〇分間、通常100ボルト。
膜への我々のタンパク質のエレクトロ後、我々は意志 今、ブロットをブロック 興味のある私たちのタンパク質の一次抗体の特定を適用してから、セカンダリ
一次抗体を認識する抗体。 カセットから膜を除去し、水で3回洗浄することによって開始します。 オプションのステップとして、我々は、タンパク質が正常に転送されたかどうかを確認することができます
ポンソー赤色で膜を染色することにより、。 5分間ポンソーで膜をインキュベートとなるまで水で洗う
バンドがはっきりしている。 検証後 ブロットは、その後、水で洗い流しを継続することにより、脱染色することができる
TBSより糸または 色素が完全に除去されるまで。 我々は、タンパク質を含まないブロットのすべての領域をブロックする必要があります。
これは、抗体の非特異的結合を防ぎ、全体的な削減します バックグラウンド信号。 一般的なブロッキングバッファーは、アッセイのための5%脱脂粉乳を含む
TBSのより糸ソリューションインチ リン酸化特異的抗体でプローブするときしかし、牛乳を使用していない
それはセシウム、その内因性リン酸化タンパク質から高いバックグラウンドの原因となりますので。 室温で1時間ブロッキング液で膜をインキュベート
温度 わずかな撹拌下。 ブロッキング液を除去し、5分間TBSより糸で洗ってください。 今、私たちは抗体を追加する準備が整いました。一次抗体を希釈
データシートに推奨濃度でブロッキングバッファーを。 穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートする。
推奨されるオプションのステップはまた、陽性コントロール抗体を使用することです ユーザーは合計等量のタンパク質を確認することを可能にするに読み込まれました
いずれかを削除することで、トラブルシューティングの各ウェルと側近 ウェスタンブロットの手順で不確実。
翌日、 一次抗体をオフにデカントし、大容量ボリュームを持つメンブレンを洗浄 TBSのより糸と激しい撹拌の 5分ごとに5回。
これらの厳格な洗浄は、非特異的な除去に非常に重要である バックグラウンド信号。 洗浄後、ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈し、インキュベート
濃度で室温で1時間のための膜 データシートをお勧めします。 今回の例では二次は後にもHRPに共役である
検出。 デカント膜とでTBSのより糸、大量の二次洗浄 5分ごとに、激しく撹拌しながら5回。
これで、検出フェーズの準備ができている。 この最終段階では、我々は、最も一般的な信号を使用して開発のデモンストレーションを行います
最も敏感で、最も安価な検出法、電気化学発光 (またはECL)反応。 この方法では、複合体中の酵素を利用
これはECL反応を触媒し、生成する二次的に結合させた 光。 次に、光はX線フィルム上に集まって開発されています
または十分に敏感な特殊なカメラを用いてデジタル化 このアプリケーションの。 私たちは、一対一の比率で等分にECL試薬を混合することにより開始
メーカーの指示に従って。 我々は動揺することなく、3〜5分間メンブレンをインキュベートします。 インキュベーション後、デカントのECL混合物と過剰を拭き取るワイプ実験室を使用する
膜の隅からソリューションを提供します。 このよう防止するためのシートプロテクターとして透明なプラスチックのラップで膜を置きます
乾燥。膜が完全に乾燥させることは避けてください。 私たちは、今どんな気泡や余分なソリューションを押し出すためにローラーを使用することができます。
直ちに膜を開発。 フィルムとカメラの両方のシステムでは、手動で露出時間を調整することができます 画像完璧なウエスタンブロットを確保するためである。
相対バンド密度は、現在市販されて良く定量することができる ソフトウェア。 。適切な分子量はまた、バンドのサイズを比較することによって確認できます
分子量のはしご。